呼吸系统疾病的诊断方法

人体呼吸道与外界相连，其感染病原体种类繁多，涵盖细菌、真菌、病毒甚至寄生虫感染。下呼吸道感染（LRTI）是全球最常见的传染病之一。由呼吸道感染引起的肺炎是导致人群发病率和死亡率的重要原因，尤其对老年人和免疫功能低下人群影响显著。尽管目前有多种实验室诊断方法，但仍有约40%需要住院治疗的社区获得性肺炎（CAP）患者难以明确病原体。因此，提高实验室诊断的准确性和有效性具有重要意义。传统的病原体检测方法，包括培养法，虽然不断改进，但仍然被认为是病原体检测的“金标准”。近年来，分子生物学诊断技术的发展已广泛应用于呼吸道病原体的微生物学诊断。
呼吸道感染病原体检测技术的发展及临床应用现状
1.1 传统呼吸道病原体检测方法
1.1.1 涂片染色显微镜检查 (1) 染色方法有很多种，常用的有革兰氏染色和抗酸染色。革兰氏染色可以区分革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性杆菌，操作简便。有报道称，革兰氏染色法检测球菌性肺炎的敏感性仅为80%左右，尤其是在社区获得性肺炎（CAP）人群中对肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌感染的检测。抗酸染色可以将细长杆状细菌染成红色，对分枝杆菌的诊断特异性较高（90%～100%），但敏感性有限。其他染色方法，如墨染，对隐球菌的诊断特异性较高，尤其适用于脑脊液样本中隐球菌的染色。然而，这些方法的敏感性较差，应与隐球菌荚膜多糖抗原检测联合使用。六亚甲基四胺银染色法适用于对经典真菌和肺炎耶尔森菌进行染色。痰液和支气管肺泡灌洗液样本中真菌感染最常用的诊断方法是荧光素标记的单克隆抗体荧光染色。(2) 显微镜观察细胞病理效应是病毒培养鉴定的重要手段。如果在呼吸道样本细胞中发现染色的碱性包涵体，则可诊断为腺病毒感染。感染细胞的病理效应包括巨细胞、合胞体形成和细胞内包涵体。显微镜检查对特定检测项目具有较高的特异性，但耗时费力。近年来，作为一种临床诊断方法，它已逐渐被分子生物学方法所取代。
1.1.2 抗原检测方法
指利用已知病原体抗体检测患者体内相应病原体抗原的方法。常用的操作方法包括乳胶凝集试验、胶体金免疫层析法、直接荧光抗体试验（DFA）等。作为快速检测流感的首选方法，乳胶凝集试验可检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒等。该方法操作简便，特异性高（90%～95%），但灵敏度低（40%～70%），这意味着阴性结果不能排除流感病毒感染。DFA可检测腺病毒、呼吸道合胞病毒等，特异性高，但结果判读可能具有主观性，且对操作人员的专业水平要求较高。隐球菌感染的首选诊断方法是使用血清和脑脊液样本进行乳胶凝集试验或酶联免疫吸附试验（ELISA）检测隐球菌荚膜多糖抗原。军团菌肺炎的诊断可通过尿液军团菌I型抗原检测与痰液琼脂培养相结合来实现。一种新型的尿液肺炎球菌抗原免疫层析检测方法可用于肺炎球菌肺炎的诊断。值得注意的是，许多患者在样本检测时已开始接受抗生素治疗，样本中可能无法培养出细菌，但抗原仍然存在于体内。因此，抗原检测方法弥补了染色显微镜和传统培养方法在这方面的不足。
1.1.3 培养方法
痰液样本和支气管肺泡灌洗液样本通常接种于血培养皿、巧克力培养皿、麦康凯培养皿等进行培养。若怀疑血流感染，则需在血培养瓶中培养病原体。临床实践中，也可针对不同的致病微生物选择专用培养基。使用BCYE选择性培养基培养呼吸道分泌物是检测军团菌感染的金标准，其特异性高但敏感性低（50%～80%）。此外，BCYE培养基也可用于诺卡氏菌的培养。诊断侵袭性曲霉病的最确切方法是从正常无菌部位获得阳性培养结果，通常使用沙氏培养基，但其敏感性较低。
1.1.4 血清学鉴定
它指的是利用免疫学检测方法和原理，检测患者体内是否存在针对已知病原微生物的抗体，从而诊断感染。常用的临床操作方法包括补体结合试验（CFT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、颗粒凝集试验、荧光抗体试验（FA）等。病原体特异性抗体通常在初次感染后约2周出现，可通过血清学检测。在分子生物学检测方法出现之前，病毒性呼吸道感染的主要诊断方法主要基于血清学，包括检测抗体滴度升高和补体结合试验。对于支原体和衣原体等非典型微生物的鉴定，提示感染上述微生物最可靠的血清学证据是急性期和恢复期血清样本中免疫球蛋白G抗体滴度升高四倍。总体而言，随着分子生物学的广泛发展，抗体检测在呼吸道感染病原学诊断中的价值正在不断下降。
1.1.5 质谱分析方法
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）主要用于临床培养中阳性菌株的鉴定，包括细菌和真菌，尤其适用于生长缓慢的分枝杆菌和各种真菌，具有快速准确鉴定的优点。然而，MALDI-TOF MS的灵敏度有限，通常不用于直接检测呼吸道原液样本中的致病微生物，无法缩短耗时的培养时间。
1.2 分子生物学检测方法
1.2.1 聚合酶链式反应（PCR）检测 PCR主要包括常规PCR、实时荧光定量PCR（RT-PCR）和数字PCR。RT-PCR在临床实践中应用广泛，且为许多人所熟知。数字PCR中最常用的方法是液滴数字PCR。该系统在PCR扩增前将待测样本分割成无数个油包水液滴，分割后，每个液滴成为一个独立的PCR反应体系。理论上，它可以实现病原微生物的绝对定量，大大提高PCR的灵敏度。PCR对大多数病原微生物的临床应用价值已得到证实：（1）当样本量大于10万个微生物时，针对结核分枝杆菌复合群的核酸探针的灵敏度和特异性可接近100%；（2）由于PCR具有灵敏度和特异性高、检测时间窗口大、周转速度快等优点，已成为流感病毒检测的首选方法，取代了抗原检测。 （3）PCR 对检测呼吸机相关性肺炎患者支气管肺泡灌洗液样本中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）具有极佳的预测价值。
1.2.2 多重快速PCR检测
多重PCR主要利用多个引物对不同病原体的核酸或耐药基因进行特异性扩增，可同时检测同一份样本中的常见临床病原体，如细菌、病毒、支原体及其耐药基因。该技术在欧美等发达国家广泛应用，例如Curetis Unvvero P50、Xpert、eSensor、FilmArray等。其检测时间极短（例如Xpert检测呼吸道病毒可在30分钟内完成），操作简便，但成本较高。多重检测的优势在于增加了识别呼吸道感染病原微生物的机会，并且在存在混合感染的情况下，可以在同一时间点检测多种病原体。病毒的分子检测结果并不一定表明感染，而是取决于受检者的身体状况和病原体的类型。多重PCR的技术难点在于：（1）引物和探针的设计需要保持良好的灵敏度和特异性，并采用特殊技术避免引物和探针之间的相互作用。同时，它也需要在操作平台上实现样本处理、核酸提取、扩增和结果判读等步骤的完全自动化，这无疑给制造商带来了技术挑战。(2) 多重PCR的目标设计也是一个重要问题。设置过多的项目，并纳入临床罕见病原体，不仅增加了产品设计的难度，也加重了医疗负担和患者的经济承受能力。对于多重PCR的阳性结果，应根据患者的具体情况和病原微生物的致病性进行综合判断。鼻病毒可以定植于健康个体的鼻咽部，而甲型流感病毒则很少这样做。
1.2.3
基于高通量测序技术的第二代测序（NGS）技术在病原体核酸检测领域的发展，为传染病的临床诊断带来了突破。目前，NGS检测临床病原微生物主要采用宏基因组学二代测序（mNGS）技术。mNGS的主要原理是对提取的病原微生物基因组DNA/RNA进行逆转录和扩增，然后随机将其切割成小的DNA片段，并进行文库构建、机器测序等实验步骤。最终生成测序数据，由专业人员进行数据分析和结果报告。在临床应用方面，mNGS能够准确分析患者样本中的所有微生物，对传染病病原体的研究具有很高的应用价值。在细菌检测方面，mNGS技术不仅可以定量鉴定病原菌，还可以获得病原菌的基因分型、耐药基因、进化水平和感染途径等关键信息，从而指导临床病原体诊断、疾病防控和疫苗研发。对于新型冠状病毒等病毒的检测，mNGS能够准确获取病毒亚型和耐药性演变的信息，这对疫情的控制、检测和疫苗研发具有重要意义；对于真菌的检测，它弥补了传统培养方法检测速度慢、灵敏度低等不足，为真菌的快速临床检测提供了一种强有力的手段。因此，mNGS为检测临床样本中存在的任何病原体及其抗生素耐药基因，以及发现新的病原体提供了一种无偏倚的方法。基于上述特点，mNGS近年来在临床实践中得到了越来越广泛的应用。在临床实践中遇到疑难或多重感染时，该技术确实解决了许多难题。然而，在mNGS技术的应用中也应注意一些问题：（1）在核酸提取过程中，如果存在许多难以突破mNGS细胞壁的微生物，例如分枝杆菌、诺卡氏菌、曲霉、毛霉、隐球菌、双相真菌等，则突破细胞壁的难度相对较大。当检测到的序列数量较少且临床高度怀疑时，应采用其他方法进行相关验证。(2) 多核苷酸测序(MNGS)灵敏度高，但易受环境微生物、工程菌和不当采集过程的影响。因此，对mNGS报告的解读需要合理，并非所有列出的微生物都应视为致病微生物。
呼吸道感染病原体检测面临的挑战
呼吸道感染是由多种病毒、细菌或真菌病原体引起的。目前，国内实验室在常见细菌的诊断方面技术较为成熟，但对于一些罕见细菌感染，例如结核分枝杆菌、诺卡氏菌、非结核分枝杆菌以及厌氧菌等，其诊断能力仍然不足。此外，在真菌方面，除了传统的真菌培养外，隐球菌荚膜多糖抗原检测和曲霉半乳甘露聚糖（GM）检测的应用提高了诊断率。然而，在分子生物学诊断方面，目前国内缺乏更有效的方法。新冠疫情爆发前，国内许多医院在呼吸道病毒检测方面较为薄弱，通常采用抗原快速检测方法，甚至选择一些价值不高但操作相对简便的抗体检测项目。疫情爆发后，国内许多二级及以上医院建立了分子生物学实验室，这为未来利用分子生物学方法鉴定传染性病原体提供了可能。同时，由于呼吸道感染的诊断方法耗时且陈旧，临床医生通常凭借经验使用广谱抗生素治疗感染，导致患者体内抗生素耐药性的出现和传播。如果肺炎链球菌引起社区获得性肺炎（CAP），则起病急骤，进展迅速，甚至可能导致患者死亡，尤其是在儿童患者中。传统的细菌涂片检查假阴性率较高，培养和鉴定耗时较长。此外，肺炎链球菌在采集、运输和培养过程中容易死亡，导致培养阳性率较低。因此，只有快速准确地诊断呼吸道感染的致病微生物，才能减少抗生素的滥用，防止耐药率进一步上升，从而达到最佳的临床控制效果。
3 总结与展望
显微镜检查和培养方法在呼吸道感染的诊断中发挥着重要作用，尤其是在免疫功能低下患者的呼吸道感染样本中，这表明传统的病原体检测方法仍然保持着金标准水平，并且其性能还在不断提高；与此同时，分子生物学检测技术的进步展现出巨大的前景，有望在灵敏度、特异性和检测时间等多个方面弥补传统检测方法的不足，成为新一代的金标准。新旧技术的结合将增强我们更准确、更快速地检测肺炎致病微生物的能力。可以预见，未来由分子生物学检测技术驱动的呼吸道病原体感染检测技术必将朝着高通量、自动化的方向发展，并成为传染病诊断的主要方法。从目前的技术角度来看，mNGS无法解决病原体快速诊断的问题，大多数方法需要24小时甚至更长时间。快速多重PCR大多可在2小时内得出结果，其应用前景广阔。然而，多重PCR的靶病原体有限，而mNGS在临床疑难感染方面具有更广泛的应用空间。